本文根据仪器学理论、分析化学理论和作者使用液相色谱、制备色谱仪器的实践，简单综述了制备液相色谱仪器的发展的新趋势、基础原理、特点；制备色谱仪器结构组成、制备色谱的分类、主要使用在等；同时，对制备色谱仪器的研发者、生产者、使用者工作中需要注意和重视的有关问题做了讨论，并对打破崇洋的思想、弘扬我国民族分析仪器等问题进行了探讨。本文可供制备液相色谱仪器的研发者、制造者、使用者参考。

  制备色谱是科研、生产工作中，特别在制药、生物、环保等行业，能够说是必不可少的仪器之一。近几年来，由于国家对分析仪器的重视，广大科技工作人员在制备色谱仪器和应用方面，做了很大的投入、付出了很多艰辛努力，取得了令人振奋的进步和丰硕成果。

  本人长期从事光谱、色谱仪器及其应用研究，通过实践，深深认识到制备色谱很重要；作者通过在色谱仪器，特别是在制备色谱的研发、使用和维修方面的实践工作取得了一些经验、教训，愿与有关的科技工作人员分享。本文主要对制备色谱仪器及其有关问题做了一些讨论，对制备液相色谱仪器的研发者、生产者、使用者、维修者和有关的管理人员都有参考作用。

  自从20世纪60年代HPLC问世以来，国内外很多科技工作人员一直在摸索如何得到HPLC的分离产物，经过长期探索，国外的有关科技工作人员首先推出了在生命科学领域应用的制备色谱仪器，例如：Biotage公司推出的Isolera制备色谱等等。

  我国的广大科技工作人员也在努力攻关，研发制备色谱仪器，并且取得了可喜的成绩。

  例如：上海科哲公司2021年推出了系列制备色谱系统。据作者参观了解的有关信息，上海科哲公司的制备色谱目前已经有：实验室型半制备/制备液相色谱系统、中试放大型制备液相色谱系统等18种产品。每一类产品又包含多种不同的型号，款款都有明确的目的性，都是按照每个用户提出的实际的需求研发的，实用性非常强。有的专为高校打造、有的专为药企打造、有的专为CRO/药企打造、有的专为科研院所打造，大大方便了各类用户对仪器的选择。其中全自动化的进样与馏分收集器，无人化操作是仪器全自动的核心，也是最重要的创新集结点。既符合集成创新的特点，又符合二次创新的特点。其中：高压系列制备色谱，已经有从100型制备液相色谱系统发展到8000型高压制备色谱系统，有10种产品可复盖全行业的用户，可供各类用户选择；中低压系列制备色谱，从1000型快速制备纯化系统发展到5000型快速制备纯化系统，可供各类用户选择；DAC中试系列制备系列，从50型制备色谱系统发展到150型制备色谱系统，可供用户任意选择。

  又如：大连依利特公司推出的P230A/P分析-半制备一体化液相色谱系统，在保证其良好准确性、重复性及宽泛流量范围等优点的同时，方便实用，实现分析与半制备系统之间的快捷切换，一机两用，极大降低用户仪器的采购成本。此外，大连依利特还推出了P3500高压恒流泵，这是大连依利特分析仪器有限公司在P230p高压恒流泵基础上，设计开发的具有自主知识产权的高压恒流泵。可大范围的应用于医药、生化、环保、质量控制等领域高效液相色谱的分析及制备，也适合在一些特殊领域作为高精度进料泵使用；小凸轮驱动短行程柱塞的双柱塞并联式往复恒流泵，取消了传统液相色谱仪缓冲器，降低了系统体积。

  上海伍丰公司推出的LC-100P系列制备液相色谱，能够完全满足常规实验室纯化制备，并可依据使用需要，搭配紫外检测器组成等度系统，高压二元梯度系统，实现实验室制备提取，大范围的使用在制药、化工、食品、生化、环保等领域。

  上海通微公司推出了半制备高效液相色谱分析系统EasySepTM-1050 高压输液泵。该产品采用浮动式柱塞安装方法，确保了柱塞杆与密封圈的同心，从而使柱塞杆与密封圈的寿命大幅延长。小凸轮驱动短行程柱塞杆设计，极大降低输液脉动。微处理器控制微步驱动电路，使得步进电机运行平稳、噪声低；采用紫外/可见光检测器，具有精密定位的光路结构，确保仪器的波长准确度和稳定能力；全新设计的数字信号直接输出模式，避免色谱信号因多次转换造成的信号畸变和干扰，降低仪器的基线噪音和漂移。仪器更采用全程数字滤波，大幅度的提升了信噪比和抗干扰能力，具备出色的检测灵敏度和稳定性。

  江苏汉邦（Han bon）公司推出的NS4000系列制备色谱，是为小试、中试放大而研发的制备色谱产品，适合不同系统的特殊使用上的要求。汉邦推出的Han bon CS-Prep工业制备色谱系统，具有高效、快速、智能、防爆等特点，在生物、医药、食品等领域有广阔的应用前景。

  总体而言，我国目前已有多个公司都在研发、生产各种不一样的制备或半制备液相色谱仪器，可以说，我国制备色谱仪器发展形势大好。但是因为篇幅所限，本文不能一一提到，希望有关的研发者、生产者、使用者们谅解。

  高效制备液相技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使它们以不同程度分布在两个不相溶的相中，且各组分可在两相的相对运动过程中，在两相中发生多次分布，进而达到分离、得到被检测物质产物的目的。

  制备液相色谱具有以下特点：1）采用色谱柱，其填料多为细颗粒多孔材料，所以分离效率高；2）应用场景范围广泛，对极性和非极性、离子型和非离子型、小分子和大分子、耐热性和热不稳定性的化合物均具备比较好的分离效果；3）根据所分离化合物的理化性质可配备不一样的检测器，如紫外检测器（UVD）、二极管阵列检测器( DAD )、荧光检测器( FD )、蒸发光散射检测器( ELSD)等，实现稳定可靠的在线）可连续自动化操作。

  制备型(Prep)色谱或纯化色谱是利用色谱方法，分离出一定量达到足够纯度的化合物，用于后续实验或处理的色谱方法。用户首先要确定目标化合物，然后开发色谱方法，将目标化合物从原料、副反应或其它杂质中成功分离出来。其总体目标是满足日渐增长的高通量和高效率需求，同时运用各种纯化技术达到相应的规模、纯度和重现性的要求。一般制备液相色谱系统的原理示意图如下：

  1）柱子粒径不同---高压制备常用10μm粒径以下的填料；中、低压制备常用20μm粒径以上的填料，一般为20-60μm。

  2）分离难度不同---中压分离难度较低，样品量大；高压分离难度较高，样品量相对较小。

  3）溶剂级别不同---中压溶剂要求比较低，常用于粗分、富集，工业级或分析级试剂；高压制备通常是色谱级。

  反相色谱流动相极性大于固定相极性，适用于能溶于水、有机混合物的中性或非离子化合物的分离。

  特点：保留时间重现性好、固定性耐用、可用甲醇、乙腈、THF作为常用溶剂，使用成本低廉。

  正相色谱流动相极性小于固定相极性，适用于不溶于水、有机混合物的亲脂样品、异构体分离。

  高压制备流路一般会用泵后高压混合，混合的效果更好。下面是高压制备色谱流路图：

  中草药是我国的国药、，是我国新药研发的宝贵资源，为了从中草药中分离出更多的有效成分，以满足化合物药效结构的高通量筛选及药理作用研究的需要，需借助于具有快速、高效的分离能力的技术。例如：糖类化合物纯化生物、黄酮类化合物纯化、生物碱类化合物纯化、生物萜类化合物纯化、生物甾体化合物纯化、别的类型天然产物纯化等等。

  高效制备液相色谱以其良好的分离度、灵敏度和较大的样品通量使其成为现阶段天然产物、中草药研究中不可或缺的重要手段，是得到被研究产物的重要仪器之一。

  下图是上海科哲的PuriMaster-3000A制备色谱仪器，用于川芎药材中7种活性成份的制备结果，效果很好。

  蛋白质和肽类药物活性强，生物功能明确，特异性高，有利于临床应用，已成为医药产业中的一大类重要产品。但这一些产品无论是来自于生物体内还是由化学合成，往往都带有复杂的混合成分，而目的蛋白或肽类的丰度又低，给分离纯化带来困难，需要多种方法联合使用以获得纯度满意的产品。在此过程中，反相制备通常在分离的最后阶段被用作获得高纯度产品的关键方法。

  色谱柱使用比较普遍的是烷基反相键合柱，例如 C18、C8 及 C4 等，具体选择可以由蛋白质相对分子质量或疏水性而定。流动相大多为甲醇或乙腈等有机相与水的混合体系，通常还添加三氟醋酸，以增加样品的溶解度，提高分离度。

  由于很多蛋白质和多肽类药物的活性强，特异性高，所以反相制备色谱，通常在分离的最后阶段，被用作获得高纯度产品的关键方法。科哲的PuriMaster-3000A制备色谱仪器，由于功能齐全，可靠性好，已经广泛被用户用来作为蛋白质、多肽等的分离、纯化仪器。

  液相色谱作为一种十分重要的分离分析技术，自60年代末期至70年代初崛起以来，一直受到生命科学界广大研究人员的格外的重视，制备液相色谱仪用于一系列生命科学前沿领域中的重大课题，并在其中发挥了特殊作用，它在包括生物大分子在内的生物活性物质的分离分析，以及制备纯化方面得到了愈来愈普遍的应用，特别是它的制备纯化能力是其它方法没有任何办法取代的。

  例如：多糖化合物纯化，有些糖类化合物没有紫外吸收，一般用示差折光检测器检测，但是示差折光检测器容易受到温度的影响，所以检测效果不理想。

  维生素的纯化方面，很多使用者采用C18、C8柱的反相制备液相色谱分离，分析脂溶性维生素等效果比较好。

  目前制备色谱的应用十分普遍，因篇幅所限，本文不能展开，请读者自己查阅有关文献。并请大家谅解。

  从仪器学理论、分析化学理论和作者的长期实践来看，作者觉得制备色谱的研发者、使用者必须认识并重视以下5个问题：

  目前国内外的制备色谱研发者、制造者、使用者在这方面都会存在一些问题。目前很多研发、使用制备色谱的科技工作人员，没有搞清楚或没有完全搞清楚制备色谱中的泵、柱、检测器三者的关系。一旦仪器制造者或使用者在制备色谱仪器出现某些问题时，不是从仪器学理论上去分析、找问题，而是闭着眼睛盲目的从泵、柱、检测器，多方面去寻找问题。往往找了很久，一事无成。所以，虽说目前国内已经有20多家公司在生产HPLC或者同时在生产制备色谱仪器，但是，都是只做泵和检测器，而做色谱柱或填料的企业都不做泵和检测器。本人认为这是阻碍我国HPLC和制备色谱仪器及其应用发展的核心问题之一。

  基于本人长期的研发和使用色谱仪器的实践经验，感到研发、使用制备色谱时，应该特别注重把泵、柱、检测器三者联合起来看，要了解三者的关系、要知道各个部件的作用、相互影响和重要性！不能顾此失彼！希望制备色谱的生产企业，要重视泵、柱、检测器三者的关系，这样才可以研发生产出高质量的整机制备液相色谱系统！因为篇幅所限，不能展开讲了。以后有机会作者将专文再讨论这些问题。

  1）色谱峰拖尾：与柱质量、流动相的流速、试样等有关，发现拖尾一定要从这样一些方面查找原因。

  所谓“柱外效应”,，就是指除柱系统外，管路、连接件、卡套、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。

  1）色谱柱的柱效：塔板数高者好，特别要注意影响柱效的因素，塔板数降到某些特定的程度该柱就报废了。

  4）色谱柱使用后一定要进行清理洗涤 ，防止造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积冲洗；隔几天再用的制备色谱仪器，最好用20%甲醇：80%水冲洗30分钟左右后，再用纯甲醇冲洗20分钟后保存。

  1）PH值很重要：一般C18柱PH小于3时，容易损坏色谱柱，但是抗酸性的柱能够正常的使用小的PH值。

  2）留意选择试剂的截止波长：如乙腈截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等等。

  3）流速：流速要适当，否则峰形难看，浪费溶剂。制备色谱应该根据制备需求的详细情况选择流速。

  调试时最好使用HPLC级的优质溶剂，溶剂使用前必须过滤和脱气，要注意以下几点：

  溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物，保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏，保证分析数据可靠。

  对过滤器总的要求是速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。

  主要目的是：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。制备色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动，造成仪器稳定性差，危害性很大。能打开排空阀，大流速冲洗。

  我国的常规制备色谱仪器基本上可以与国外同类同档次的仪器抗衡，即：有些指标与国外仪器相当、有些指标优于国外仪器、少数非关键的指标不及国外仪器。有人说：“很多用户崇洋，不愿意使用国产仪器”；有人说：“他们是质检部门，工作很重要，国产仪器数据不准确！必须用进口仪器”；还有人说：“他们是进出口产品检验工作，面对外国人，我们要求得到外国人的认可”…作者觉得这些说法完全是一种借口，事实并非如此。

  作者作为一个中国科学院的用户、作为一个年长的科技工作人员，可以负责任的、坦率的、骄傲的对大家说，我是中国科学院第一个使用国产光谱仪器（紫外可见分光光度计TU-901）、色谱仪器（FD-高效液相色谱）的科技工作人员。我还能告诉大家，用户不是一定要用进口的仪器的。

  例如：作者曾经研发了一台HPLC，采用了自制的高压泵、自制的检测器和国产的色谱柱。整个HPLC在美学性方面远远不及国外的HPLC，但是，我们用它在多肽、核酸等有机化学领域的科研工作中，解决了很多实际问题，发表了不少论文，效果很好。当时，中国科学院化学所和北京大学各有一位科技工作人员在我们单位搞协作，他们把这个情况告诉了自己单位的有关领导和有关科技工作人员。结果，这两个单位的老科学家、老教授都主动提出要求购买我们研发的HPLC。我们问他为啥不买进口HPLC？为何需要买我们这样难看的仪器？他们异口同声的回答说：“你们的HPLC不像国外某些厂商的HPLC，他们的仪器价格昂贵、性价比低、并且低浓度的样品做不出来，有时很难重复文献值；而你们的HPLC适用性很强、技术指标实在、分析检验测试的数据准确可靠，在实际在做的工作中能处理问题”。这是怎么回事呢？因为一般科研工作大多数都是从重复文献开始，而仪器学理论告诉我们，噪声是HPLC分析检测误差的大多数来自之一，它限制对被分析检测样品的浓度。如果在分析测试工作中，HPLC的噪声大了，样品浓度稍微稀一点，就因为噪声将样品的信号淹没了，就无法检测出结果。很多进口HPLC的噪声大，低浓度样品重复不出文献值、有时分析检测的数据也很不准确。所以，这个例子充分说明：广大新老用户需要的不一定是进口仪器，而是要求稳定可靠的仪器、是能得到准确可靠数据的仪器、是性能好价格低的仪器。

  至于什么“质检工作要求高”、“求外国人认可”，这些都是站不住脚的歪理。例如：我国的三聚氰胺事件中，为了建立国家检验测试标准，经过10多家实验室确证，并经专家组审核检查通过，决定采用HPLC法作为国家三聚氰胺标准检验测试仪器，并确定指标为：检验测试范围为0.3mg/Kg-100mg/Kg；检测限0.05mg/Kg。

  当时国家急于建立标准，决定采用招标方式选择建标中使用的仪器。大家找了北京普析通用与另外两家国外生产的HPLC仪器作为竞标对象。当时根本就没有想到国产HPLC会中标，只是担心有人质疑建立国标不用国产仪器，是崇洋的做法，所以选了普析通用的L6型HPLC。当时大家决定由国家标物中心拿出盲样，对三家仪器进行比对测试。比对测试的结果，普析通用和国外一家品牌产品的数据与标样数据非常接近，两家的比对测试数据基本一致，三家中排名前两名。最后，专家、领导共同讨论，从比对测试的数据可靠性、仪器的性价比、制订国标等多个因素全方位考虑，国产仪器L6中标。普析通用的L6型（现已升级到L600型）被选为《原料乳三聚氰胺快速测定--液相色谱法》国家标准起草时使用的唯一国产品牌的HPLC。

  随后，在国家建标过程中，采用普析通用的L6系列高效液相色谱仪，建立了奶粉/牛奶中三聚氰胺的HPLC-UV检测的新方法。奶中的三聚氰胺经1%三氯乙酸溶液提取，提取液加乙酸铅溶液沉淀蛋白，离心后上清液经混合型阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX,60mg/3ml）净化，洗脱液吹干后定容，用L6型高效液相色谱仪进行测定，最低检测限为0.0416mg/L（优于安捷伦的HPLC检测结果），回收率为：95.87%-105.21%，在1-50ppm之间有良好的线）。这个工作要求不高吗？这个比对工作外国人能不认可吗？这里能说明用户崇洋吗？回答都是否。同时，这个例子说明国产HPLC不比进口的差，说明国产HPLC有些地方优于进口同类同档次的产品。

  从仪器学理论和使用者的实际要求、从仪器的性价比和售后服务等全方位来讲，进口液相制备色谱和国产制备色谱的质量都相差无几，例如：

  除上述几个例子外，还有很多很多，都可说明国产制备色谱仪器不比进口差，国产的各类制备色谱仪器虽说各有千秋、可能还存在某些不足之处，但是能满足各种常规分析检测的要求、能够完全满足第三方检测和各类制备工作的使用要求。

  我们看到国产制备色谱仪器的成就的同时，我们还应该看到国产制备色谱仪器与国外的差距，主要体现在附件、工艺、软件方面。通常来说，国产制备色谱的附件相比国外同类仪器的附件偏少，因为多一种附件就是多一种功能、多一种适用性。工艺方面，我们国产仪器在美学性方面与国外还有一些差距。软件方面也是如此，科技部调查研究之后发现，我国广大科技工作人员中90%对国产分析仪器的软件不满意，认为在仪器的智能化程度、软件的算法等方面还应该努力赶超。因为人家国外公司干了一、二百年，我们才干几十年，所以存在差距是正常的。但是咱们不可以只看到成绩，看不到差距。我们有些科技工作人员盲目崇洋是不对的，盲目排外也是不对的。盲目崇洋和盲目排外都是阻碍我国分析仪器发展的大敌。所以，特殊工作中特殊需要的、我们还不能生产的那些仪器，还是该大胆引进、消化、吸收、并且一定要为我所用。

  我国目前的分析仪器行业中，非公有制企业为数不少。作者通过参加国家科技部重大仪器专项的工作，发现我国分析仪器领域中非公有制企业占比很大，例如：上海科哲公司、上海通微公司、北京普析公司、浙江福立公司等等，都曾经是国家科技部的光谱、色谱重大分析仪器及其应用项目的承担单位之一。作者通过参加科技部有关重点项目的工作、通过参加上海市仪器项目的验收、评审以及现场参观学习等，对有些非公有制企业有了比较深入的了解。例如：北京普析通用、上海科哲公司、浙江福立公司、聚光公司等都是作者接触较多的非公有制企业之一。作者为非公有制企业对分析仪器行业的贡献感到高兴、自豪。目前，上海科哲公司推出的多种制备型的液相系列新产品都具有很多特色，都能满足第三方检测和各类用户的使用上的要求，深受广大新老用户的好评。

  希望中国分析仪器行业继续努力，不断推出开拓、创新型的分析仪器，努力多为我国的色谱仪器赶超国际领先水平多做贡献。为我国的民族分析仪器多做贡献。

  致谢：本文写作过程中，上海科哲公司的张建明总工程师、上海通微和上海伍丰等公司的有关专家，为作者提供了许多有用的资料，作者对他们的帮助，在此一并表示衷心感谢。

  [2]李昌厚著，《高效液相色谱仪器及其应用》，北京：科学出版社，2014

  [3]李昌厚，用好HPLC的九大关键问题，仪器信息网，2020/2/26

  李昌厚，男，中国科学院上海营养与健康研究所原仪器分析室主任、生命科学仪器及其应用研究室主任、教授、博士生导师、华东理工大学兼职教授，

  年开始，终身享受国务院政府特殊津贴。主要研究方向：长期从事分析仪器开发研究和分析仪器应用研究。主要是做光谱仪器（紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、激光拉曼光谱等）及其应用研究；色谱仪器（液相色谱、气相色谱等）及其应用研究；特别对《仪器学理论》和分析仪器指标检测等方面有精深研究；以第一完成者身份，完成科研成果15项；由中科院组织专家鉴定，其中13项，达到鉴定时国际上同类仪器的领先水平，2项填补国内空白；以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项（含国家发明奖1项）；以第一作者身份发表论文280篇（退休前发表论文183篇、退休后发表论文97篇）；出版了光谱、色谱等仪器与应用紧密结合的专著5本；曾任中国仪器仪表学会理事、中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届副理事长、全国光谱仪器专业委员会付主任、全国物理光学专业委员会付主任、全国高速分析专业委员会付主任；国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员、国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组组长、上海市科学仪器专家组组长、《光学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编、《生命科学仪器》副主编、上海化工研究院院士专家工作站成员、《仪器信息网》等十多个高科技学术团体的顾问、专家委员会成员等职。曾任北京普析公司、美国ISCO公司等十多个高科技公司的技术顾问、技术专家组组长；为各省市、自治区、有关学会和有关公司召开的各类学术（技术）交流会、技术培养和训练会作报告、讲课600次以上，为中国民族分析仪器的发展做出了应有的贡献。